EL ANÁLISIS DE BIOMOLÉCULAS FÓSILES Y SUS POSIBILIDADES EN PALEONTOLOGÍA

Paul Palmqvist





Según Simpson, la Paleontología es la ciencia que se ocupa del estudio de los fósiles bajo todos los puntos de vista y, a través de ellos, de la reconstrucción de la vida en el pasado geológico. El paleontólogo cuenta con una importante ventaja de cara al estudio de la evolución de la biota, a diferencia del neontólogo, al disponer del registro fósil para acceder a su dimensión histórica, pero la propia naturaleza de este registro (que representa sólo una pequeña muestra no aleatoria de la vida en el pasado) ha impuesto una serie de limitaciones a los trabajos que se efectúan en nuestra disciplina. Tal y como indicara Efremov, los fósiles representan el resultado de una transferencia de materia desde la biosfera hasta la litosfera, que en la mayor parte de los casos suele ir acompañada de una pérdida sustancial de información. Una de las consecuencias más importantes de dichos procesos es que normalmente sólo se conservan los tejidos esqueléticos mineralizados, por lo que el estudio de los fósiles se ha visto estrechamente limitado al de su morfología. No obstante, durante las dos últimas décadas se han abierto nuevas perspectivas con la incorporación de técnicas de la Biología Molecular en los estudios paleontológicos y arqueológicos, que posibilitan el análisis de la información preservada en las biomoléculas del pasado.
Dos han sido los enfoques seguidos con vistas a recuperar esta información bioquímica: la amplificación de secuencias de DNA fósil, mediante la técnica de la PCR (polymerase chain reaction), y el análisis de la especie-especificidad de proteínas fósiles, usando métodos inmunológicos. Su aplicación ha permitido recuperar información sobre diversas especies fósiles o extinguidas en tiempos históricos por el hombre, p. ej. el cuaga [Higuchi et al., Nature, 312: 282 (1984); Hughes, Trends Ecol. & Evol., 3: 95 (1988)], los hemiones del Pleistoceno superior [Höss & Pääbo, Nuc. Acids Res., 21: 3913 (1993)], el félido con dientes de sable Smilodon fatalis de la formación Rancho La Brea [Janczewski et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 89: 9769 (1992)], el lobo marsupial [Thomas et al., Nature, 340: 465 (1989)], el perezoso gigante Mylodon [Pääbo, Proc. Nat. Acad. Sci., 86: 1939 (1989)], el mamut [Prager et al., Science, 209: 287 (1980)], las magnolias del Mioceno [Golenberg et al., Nature, 344: 656 ( 1990)] o los dinosaurios del Cretácico [Woodward et al., Science, 266: 1229 (1994)], así como sobre diversas poblaciones humanas prehistóricas [Pääbo, Nature, 314: 644 (1985); Cattaneo et al., Nature, 347: 339 (1990); Hagelberg et al., Phil. Trans. Roy. Soc. Lond., 333: 399 (1991); Meijer et al., Bioch. Bioph. Res. Com., 2: 367 (1992)].
Desde esta perspectiva, la Tesis Doctoral de Concepción Borja Pérez, presentada en Granada (Junio de 1995) con el título ŒDetección y caracterización de proteínas fósiles mediante técnicas inmunes¹, reviste un especial interés. Este trabajo ha sido dirigido por el Prof. Enrique García Olivares, del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Granada, y supone la culminación de una prolongada labor investigadora, desarrollada en un área especialmente compleja, con escasos antecedentes (especialmente en España) y de difícil interpretación. En ella se han seguido numerosos protocolos y metodologías con vistas a la detección y caracterización de especie-especificidad de las proteínas fósiles (diversos procedimientos de extracción, uso de abundantes antisueros policlonales y anticuerpos monoclonales, técnicas ELISA y dot-blotting, esta última mejorada mediante un procedimiento inédito para la cuantificación de la reactividad, sueros antifósiles, etc.) y se han usado estrictas pruebas de control. Además, los análisis se han aplicado a numerosos restos óseos modernos y paleontológicos, estos últimos comprendiendo distintas edades y contextos sedimentarios (yacimientos de Orce, Cueva Victoria y Atapuerca). Por otra parte, las hipótesis emitidas con vistas a la interpretación de los resultados obtenidos, así como para explicar los múltiples problemas de detalle planteados (p. ej., la obtención de respuesta inmune para una proteína y no otras en determinadas muestras, o las cantidades detectadas en fósiles provenientes de distintos yacimientos) aparecen bien fundamentadas. En función de todo ello, esta Tesis constituye un trabajo de investigación modélico, que marcará un punto obligado de referencia en Paleontología Molecular.
Entre los resultados más interesantes que ofrece la Tesis, merecen destacarse los obtenidos del estudio de los escasos y problemáticos restos paleoantropológicos encontrados en los yacimientos del Pleistoceno inferior de la región de Orce-Cueva Victoria. Desde 1982, las excavaciones efectuadas en Venta Micena han suministrado diversos fósiles potencialmente pertenecientes a homínidos, consistentes en un fragmento craneal infantil de la región obélica (VM-0) y en dos diáfisis humerales, una de las cuales se encuentra completa (VM-1960) y perteneció, casi con toda seguridad, al mismo individuo que el fragmento craneal. En Cueva Victoria se ha encontrado una falange (CV-0) [Palmqvist et al., J. Arch. Sci., 23: 95 (1996)] y varios fragmentos de diáfisis humerales de individuos adultos. El estudio de estos fósiles ha resultado bastante problemático, debido a su estado de fragmentación, lo que ha impedido que las técnicas convencionales de anatomía comparada sean plenamente aplicables, debiéndose entonces buscar enfoques morfométricos más resolutivos, como el análisis fractal de las suturas de VM-0 [Gibert y Palmqvist, J. Hum. Evol., 28: 561 (1995)]. Además, en el caso de este último fósil, la presencia de una cresta en su cara interna, de dirección sagital, llevó a algunos investigadores inicialmente a cuestionar su naturaleza humana (no obstante, dicha cresta se encuentra también en otros cráneos de homínidos de edad similar, como la calota de Trinil; véase Martínez Navarro, Rev. Esp. Paleont., 11: 120 (1996)), lo que desgraciadamente ha traído como consecuencia que la polémica asociada a estos fósiles haya impedido valorar adecuadamente el verdadero patrimonio de Orce, que es su fauna de macromamíferos del Pleistoceno inferior, única en Euroasia.
El estudio inmunológico realizado por Borja ha permitido detectar y caracterizar en algunos de estos especímenes albúmina y otras proteínas fósiles humanas, como la Inmunoglobulina G (IgG), empleando diversas técnicas para su extracción de la matriz ósea (lavados con sueros salinos, ataques con EDTA y ácido acético). No se obtuvo reactividad con los extractos obtenidos de los lavados y en los tratamientos con acético la señal fue débil o no se produjo; por el contrario, en las muestras tratadas con EDTA se obtuvo la mayor reactividad, lo que indica la íntima unión de las proteínas a la matriz ósea, descartando la contaminación superficial. Resulta interesante señalar la presencia de señal para algunos de los anticuerpos monoclonales usados en el análisis de un mismo fósil y la ausencia para otros, lo que indicaría que los epítopos (cadenas de aminoácidos) que éstos reconocen en la proteína no se preservaron durante la fosilización, permitiendo ello también excluir que las proteínas provengan de contaminación reciente. VM-0 y VM-1960 mostraron una mayor afinidad con la albúmina e IgG humanas que con las de caballo o babuino, mientras que 5 de los 6 fósiles de équido analizados suministraron una respuesta más fuerte a los anticuerpos de caballo. Estos resultados se presentaron en el Congreso Internacional de Paleontología Humana celebrado en Orce (septiembre de 1995), donde fueron corroborados por el Prof. Jerold M. Lowenstein, de la Universidad de California (San Francisco), pionero en la aplicación de técnicas como el radioinmunoensayo (RIA) en Paleontología Molecular, quien detectó cantidades significativas de albúmina y otras proteínas en diversos fósiles de Orce y Cueva Victoria: p. ej., 4 ng/ml de albúmina humana en VM-0 y VM-1960, frente a 0 ng/ml de albúmina de caballo en ambos y sólo 1 ng/ml de albúmina bovina en el segundo (pese a ello, en VM-79, uno de los fósiles de Equus altidens analizados, detectó 10 ng/ml de albúmina de caballo y, sorprendentemente, 34 ng/ml de humana).
Estas aplicaciones de la Biología Molecular abren, ciertamente, grandes posibilidades de cara al futuro, con vistas a la utilización en Sistemática y Paleontología Evolutiva de información bioquímica obtenida a partir de especies extintas. Ahora bien, por el momento conviene no aceptar sin reservas los resultados que estas metodologías ofrecen, al menos hasta que estén totalmente puestas a punto y suficientemente contrastadas. Así, en un artículo publicado recientemente [J. Arch. Sci., 23: 139. (1996)], S.J. Fiedel efectúa una llamada de cautela sobre toda una serie de resultados contradictorios obtenidos mediante el uso de las técnicas inmunológicas en el análisis de proteínas preservadas en fósiles y sobre la superficie de industrias líticas. Por ejemplo, en diversos análisis efectuados usando el método de ensayo ELISA o la técnica de inmunoelectroforesis cruzada (CIEP), se ha detectado la presencia de restos de proteínas pertenecientes a especies que no se encuentran representadas en los restos fósiles de los yacimientos arqueológicos estudiados y que en algunos casos se habían extinguido ya en esa región o incluso nunca llegaron a habitarla. En la mayoría de tales análisis, estas contradicciones se explican por reacciones cruzadas entre las especies, aunque en algunos casos se han obtenido resultados claramente inconsistentes, como la detección por Lowenstein, utilizando el método RIA, de una débil señal de proteínas humanas en una sustancia rojiza preservada sobre la superficie de una concha de ceremonial maya, la cual luego resultó ser incienso. Más importante aún, en una serie de pruebas comparativas realizadas por distintos autores usando RIA y CIEP sobre las mismas muestras (artefactos, sedimento, sangre humana y de bovino modernas, solución de control con hidróxido de amonio al 5%), sobre cuya composición no se les informó previamente (a fin de evitar el condicionamiento de los resultados), se obtuvieron resultados diferentes con ambos métodos: con la técnica RIA se identificaron correctamente las muestras de sangre moderna, aunque para la humana se obtuvo una débil señal adicional de oso, y no suministró resultados positivos en ninguna de las arqueológicas, mientras que con CIEP se identificaron las muestras de sangre moderna de bóvido, se apreciaron resultados en la mitad de las arqueológicas y, paradójicamente, se obtuvo también una señal débil indicativa de la presencia de proteínas de conejo en la muestra de control sin proteínas.
No obstante, quizás la evidencia más concluyente sobre la fiabilidad que actualmente presentan estos métodos sea la que suministra el experimento realizado por Cattaneo et al. [World Arch., 25: 29 (1993)]. En dicha prueba se enterraron fragmentos óseos quemados y lascas de sílex que habían sido impregnadas con sangre de bóvido. Según pudieron apreciar, al exhumarlos secuencialmente, sólo un artefacto retenía restos de albúmina bovina tras un año de permanecer enterrado y ninguno de ellos conservó inmunoglobulina; dos fragmentos de hueso humanos, exhumados tras dos meses y dos años, respectivamente, mostraron una señal positiva para la albúmina humana, pero tampoco en ninguno se preservó inmunoglobulina (detectada por Borja y García Olivares en VM-0, fósil de una antigüedad superior a 1Ma). La conclusión evidente es que son necesarios nuevos estudios, especialmente con vistas a estimar cómo afecta el tipo de ambiente geoquímico durante la fosilización a la preservación de las biomoléculas (p. ej., en el estudio de Borja se constatan mayores cantidades de proteínas en los restos de Orce que en los de Atapuerca, bastante más modernos), así como cuáles son las diferencias de detectabilidad y, en definitiva, el grado de confianza que merecen las diferentes metodologías usadas en este tipo de análisis.


Paul Palmqvist es Profesor Titular de Paleontología.