Protoplastos


Carlos López Encina




¿Qué es un protoplasto?: Un protoplasto vegetal puede definirse como: «La parte de la célula vegetal que está delimitada e incluida dentro de la pared celular y que puede ser plasmolisada y aislada por eliminación mecánica o enzimática de la pared celular. El protoplasto es por lo tanto una célula desnuda, rodeada por su membrana plasmática, potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse» (Vasil, 1976).
¿Cuál es su historia?: El pionero en el aislamiento de protoplastos fue Kiercker, que consiguió en 1892 obtener los primeros protoplastos por métodos quirúrgicos, complejos y poco eficaces. Hubo que esperar 68 años hasta que Cocking (1960) demostró la posiblidad de aislar por métodos enzimáticos grandes cantidades de protoplastos viables. Una vez establecida la eficacia del método enzimático y su enorme superioridad sobre el método quirúrgico, la técnica ha sido objeto de multiples refinamientos y ajustes, siendo aplicada a multitud de especies vegetales con diverso éxito.
¿Para qué sirven?: Los protoplastos son una herramienta fundamental para la investigación en biología fundamental y aplicada. La ausencia de una pared celular rígida (obstáculo físico-químico) y la completa exposición de la membrana celular convierte a los protoplastos en un sistema ideal para la investigación en procesos de transporte y división celular, morfogénesis, mutagénesis, selección, etc. Quizá la aplicación más utilizada actualmente es la transformación genética por hibridación o fusión somática, por introducción-absorción de proteínas, DNA (vegetal, vírico o bacteriano), macromoléculas, etc. En fitopatología se utiliza para estudiar la etiología de los virus, su absorción, procesos infectivos y replicación; la especificidad y modo de actuación de hongos y bacterias patógenas, la evaluación de toxinas, y finalmente la obtención-selección de clones resistentes a diversos patógenos y productos fitosanitarios para la mejora genética.
¿De dónde se obtienen?: De muy diversas partes de la planta, cultivadas tanto in vitro como ex vitro. Así pueden obtenerse protoplastos de tejidos de callo, ápices de raíz, cladodios, ápices de tallo, frutos, nódulos de raíces, coleóptilos, láminas de aleurona de cereales, microsporas e incluso de tubos polínicos, pero en la actualidad la fuente de protoplastos más habitual es el tejido de mesófilo de las hojas jovenes.
¿Cómo actúan los enzimas?: El aislamiento de protoplastos depende en gran medida del tipo y concentración de los enzimas utilizados. Los dos enzimas esenciales son la celulasa y la pectinasa, que degradan específicamente los componentes celulósico y pectínico de la pared celular. Algunos tejidos tambien requieren hemicelulasas adicionales para una correcta digestión de la pared. Otros preparados enzimáticos como la driselasa desarrollan un conjunto de actividades líticas: celulasas, laminarinasas, xilanasas, pectinasas. Todos los preparados enzimáticos incluyen impurezas, como nucleasas y proteasas, que pueden tener un efecto negativo sobre la viabilidad celular. Los enzimas son pH dependientes (4-6) ysu temperatura óptima de actuación es de 40 a 60°C. Debido a la fragilidad osmótica de los protoplastos, es necesario controlar perfectamente el potencial osmótico tanto de la solución enzimática, como de la solución de lavado y de la solución de recuperación y cultivo de los protoplastos. Para ello se usan osmóticos iónicos o no iónicos como sorbitol, manitol, sacarosa, glucosa, cloruro cálcico, etc, a distintas dosis.
¿Cuáles son las fases del protocolo?: La primera fase es la obtención, preparación y desinfección del material vegetal. La segunda fase es la eliminación de la pared celular mediante enzimas líticos, en una solución con un alto potencial osmótico. La tercera fase es la recuperación de los protoplastos, incluye la eliminación de los enzimas por lavado y el paso a un medio de cultivo para la recuperación de la pared y la promoción de las primeras divisiones celulares de las células individuales obtenidas de los protoplastos. Así como la regeneración de la pared no representa ninguna dificultad, ya que ocurre inmediatamente al eliminar los enzimas, la fase de división celular, suele ser muy problemática y por diversas causas necesita la cuidadosa purificación y manipulación previa de los protoplastos así como la puesta a punto de un medio de cultivo específico y complejo, con sales minerales, vitaminas, carbohidratos, reguladores de crecimiento y una dosis reducida paulatinamente del agente osmótico; esto se realiza incubando el material a unos 25°C en condiciones de oscuridad de 5 a 7 días. En esta fase se realizan los tratamientos y la selección del material frente a diversos agentes. La cuarta fase es el cultivo de los microcallos obtenidos tras la división celular, se cambia en ella la densidad poblacional, la composición del medio de cultivo, que se hace menos exigente y la incubación se hace con luz. La quinta fase es la regeneración de plántulas a partir del tejido de callo, mediante modificaciones de la composición hormonal-mineral del medio de cultivo. La sexta fase es el transplante y aclimatación de las plantas obtenidas en invernadero.
¿Cómo está el tema en la actualidad?: A pesar de que los avances de los últimos diez años se pueden calificar de espectaculares y continuamente se pone a punto la técnica para nuevas especies, la aplicación de estas técnicas se ha estabilizado o ralentizado un poco, ya que a la dificultad propia de la técnica, que solo permite su utilización rutinaria en un número limitado de especies modelo, se une el cambio de moda u orientación de la ingeniería genética, que de pasar necesariamente por los protoplastos y su fusión, ha cambiado a otros métodos de transformación genética, algo mas sencillos y dirigibles, aunque sin invalidar en absoluto estos métodos basados en los protoplastos en los que se sigue trabajando activamente.

Carlos López Encina es Colaborador Científico en la Estación Experimental La Mayora (CSIC).