Proteínas morfogenéticas óseas: la medicina que viene (I)

José Antonio Andrades Gómez

En pocos meses se permitirá la utilización clínica de las proteínas óseas morfogenéticas BMP-2 y BMP-7 (esta última también conocida como proteína osteogenética uno, OP-1) en humanos. La futura disponibilidad comercial de estas proteínas producidas mediante ingeniería genética revolucionará la cirugía ósea restauradora, ya que mediante su utilización clínica será posible, por primera vez, inducir la formación de tejidos óseos en el sitio afectado, prescindiendo, en muchos casos, de los transplantes óseos autólogos o materiales de sustitución ósea.

Introducción

La historia de las BMPs comenzó en 1889 con las investigaciones del cirujano americano Senn, que utilizaba implantes óseos desmineralizados en la cirugía ósea restauradora. A mediados de la década de los sesenta, el profesor M.R. Urist, de la Universidad de California en Los Ángeles, descubrió que los huesos alógenos desmineralizados implantados entre el músculo formaban hueso nuevo [Urist M.R., Science 150: 893-899 (1965)]. En 1973, este investigador y su equipo lograron extraer del tejido óseo una mezcla proteica heterogénea con propiedades para formar hueso en partes blandas, y que recibió el nombre de "proteína morfogenética ósea". Cien años después de los estudios de Senn, Wang y cols. aislaron, mediante la extracción química de matriz ósea bovina, una fracción proteica altamente inductiva con un peso molecular de 30.000 Da [Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 220-224 (1990)]. Tras la secuenciación enzimática, Wozney y cols. lograron clonar las proteínas BMP-1 a BMP-14 [Wozney et al., Science 242: 1528-1534 (1988)]. Hasta la fecha se han aislado y clonado más de 40 BMPs de diferentes tejidos. Las proteínas BMP-1 a BMP-7 están presentes en los tejidos óseos humanos, y las BMP-2 a BMP-7 tienen propiedades osteoinductivas [Dudley et al., Genes Develop. 9: 2795-2807 (1995)]. Aproximadamente, existe un microgramo de cualquiera de estas proteínas por kilogramo de tejido óseo.

Las BMPs son proteínas formadas por dos cadenas polipeptídicas idénticas. Tras la disociación de las correspondientes secuencias de propéptidos se produce la proteína biológicamente activa. Con excepción de la BMP-1, que es idéntica a la proteinasa de procolágenos C, todas las BMPs presentan restos de cisteína en su extremo C7 terminal y, en consecuencia, se engloban en la familia de proteínas del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-ß). Entre los miembros de esta amplia familia, emparentados con las BMPs, se encuentran, entre otros, la activina y la inhibina. En la familia BMP también se incluyen los llamados factores de crecimiento/diferenciación (growth differentiation factor, GDF). La BMP-12 y BMP-13 representan el homólogo humano del GDF-7 y GDF-6 de rata, respectivamente. Éstos están emparentados con el GDF-5 (BMP-14), que colabora en el desarrollo de cartílago y hueso en las extremidades de la rata. En virtud de sus propiedades de formación de cartílago, el GDF-5 y GDF-6 también han sido relacionadas con las propiedades derivadas de cartílago 1 y 2 (cartilage derived morphogenetic protein, CDMP-1 y CDMP-2) [Chang et al., J. Biol. Chem. 269: 28227-28234 (1994)]. En la tabla 1 se representan los miembros de la familia de BMPs de mamíferos descubiertos hasta ahora.

En los últimos años, también se han identificado los genloci para BMP-2 a BMP-7 humanas, habiéndose localizado en el cromosoma 20, el genlocus para BMP-3 en el cromosoma 4, el genlocus para el BMP-4 en el cromosoma 14, así como los genloci para el BMP-5 y BMP-6 en el cromosoma 6 [Kübler N.R., Biomaterials 1: 11-17 (2001)]. Recientemente, además, se ha logrado el análisis de estructuras radiográficas de BMP-2 y BMP-7 cristalizadas. La estructura tridimensional de ambas proteínas muestra una gran similitud con el TGF-ß2 y el TGF-ß3, respectivamente [Scheufler et al., J. Mol. Biol. 287: 103-115 (1999)].

Receptores de BMPs y células diana

Los estudios de Urist demostraron que la diferenciación de las células mesenquimáticas pluripotentes son los efectores de las propiedades osteoinductoras de las BMPs. En ese proceso de diferenciación dichas células constituyen lugares diana de las BMPs en tejidos blandos, tales como músculo, periosteo y tejido blando subcutáneo, así como en las células madre de la médula ósea. Las BMPs desarrollan su actividad biológica mediante unión a los receptores de superficie de estas células diana. Diversos estudios han revelado que los receptores de TGF- ßs y BMPs están emparentados. Las proteínas se unen a los receptores transmembranales serina/treonina/quinasa de Tipo I y Tipo II específicos, que forman complejos heterodímeros en las superficies de las membranas de las células diana [Nohno et al., J. Biol. Chem. 270: 22522-22526 (1995)]. A resultas de la fosforilación del complejo proteína-receptor Tipo II, se produce una fosforilación de proteínas segundo mensajero específicas, localizadas en el citosol, las llamadas proteínas Smad. Éstas constituyen trímeros que, tras su translocación al núcleo, inician la transcripción del llamado "gen de respuesta" [Kretzschmar et al., Genes Dev. 11: 984-995 (1997)]. Hasta la fecha se conocen cinco proteínas Smad citosólicas diferentes en vertebrados. Las Smad 1, Smad 4 y Smad 5 se consideran los marcadores intracelulares esenciales de las BMPs para la formación de heterodímeros o heterotrímeros.

Los monocitos humanos presentan entre 750 y 1000 complejos-receptores de BMP. Basta un enlace de dos o tres receptores por célula con la BMP-4, a muy bajas concentraciones, para producir un estímulo quimiotáctico en esas células. Este estímulo es necesario para que las células diana indiferenciadas migren hacia el lugar del implante de BMP-4. Allí, de acuerdo con la elevada concentración local de TGF- ßs y BMPs, se produce la proliferación y diferenciación de las células mesenquimales [Cunningham et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11740-11744 (1992)].

Clonación de BMPs

La mayoría de los conocimientos bioquímicos y de actividad biológica de las diferentes BMPs se han obtenido de proteínas producidas mediante ingeniería genética, ya que la concentración de estas proteínas en tejidos es extremadamente baja. La mayoría de las BMPs se han expresado en células de mamíferos: la BMP-2 generalmente se expresa en células de ovario de hámster (células CHO), a través de su secreción al medio de cultivo. La BMP-4 se ha expresado hasta la fecha en líneas celulares embrionarias de riñón humano, así como en células de una línea de células madre sanguíneas de mono (células BSC) o en células CHO. La expresión del heterodímero xBMP-4/BMP-7 se ha realizado en células de insectos.

En el laboratorio del Profesor Sebald en Wurzburg (Alemania) se logró expresar por primera vez BMP-2 y BMP-4 en un sistema bacteriano utilizando E. coli. Para ello, se aisló el cRNA de la línea celular de osteosarcoma humano U2Os, y de ésta se obtuvo la poli A(+)mRNA, a partir de la cual se sintetizó un cDNA como patrón. Tras confeccionar los primers oligonucleótidos correspondientes, se amplificó el cDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El fragmento de DNA de las BMP-2 o BMP-4 se clonó en un vector de expresión, se transformó en la bacteria y se indujo la expresión de la proteína correspondiente en forma de monómeros, dentro de cuerpos de inclusión citoplasmáticos. Tras la renaturalización de la proteína, el proceso acaba con la purificación cromatográfica de la misma [Ruppert et al., Eur. J. Biochem. 236: 295-302 (1996)].

Como veremos en el artículo "Proteínas Óseas Morfogenéticas: La Medicina que viene (II)" de un próximo número de esta revista, la base biológica para que las proteínas BMP-2 y BMP-7 estén a punto de ser aprobadas para su uso clínico radica en que, en general, las BMPs desempeñan un papel decisivo en la diferenciación embrionaria de tejidos y órganos, así como en su capacidad osteoinductiva postfetal.

José Antonio Andrades Gómez es Profesor Titular en el Departamento de Biología Celular y Genética de las UMA.