Técnicas de detección y análisis de biomoléculas individuales

Miguel Ángel Medina Torres

Las biomoléculas interactúan entre sí y se asocian para formar máquinas moleculares que cumplen variadas y fundamentales funciones en los seres vivos. Las estructuras y funciones de las biomoléculas están siendo determinadas gracias al empleo de recientes avances tecnológicos de la biología estructural y molecular. Sin embargo, tanto la estructura de las biomoléculas como las interacciones entre ellas cambian dinámicamente, lo cual hace muy importante poder avanzar en el estudio de las propiedades dinámicas de las biomoléculas. Lamentablemente, los métodos de medida habituales implican a gran número de moléculas y, por tanto, las propiedades dinámicas son promediadas y no pueden ser observadas. La reciente implantación y desarrollo de técnicas de detección y análisis de moléculas individuales (SMD, del inglés "single-molecule detection") está permitiendo el acceso a ese tipo de información que, hasta hace poco, permanecía oculta.

No es una exageración afirmar que las técnicas SMD están abriendo una nueva era de la investigación biológica. Las técnicas SMD permiten la visualización y manipulación de moléculas aisladas sin dañarlas. El análisis de moléculas aisladas está actualmente dominado por tres tipos de aproximaciones metodológicas diferentes: la técnica electrofisiológica del pinzamiento zonal de membranas, la microscopía de fuerza atómica y métodos ópticos basados en la fluorescencia. Analicemos sucintamente cada una de ellas.

Técnica del pinzamiento zonal de membranas.

La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre los canales iónicos procede de la implantación de la técnica del pinzamiento zonal ("patch-clamp", en inglés), introducida en 1976 por Erwin Neher y Bert Sakmann (lo que les valió a ambos el Premio Nobel de Medicina y Fisiología en 1991). Esta técnica permite el registro de las corrientes iónicas a través de zonas minúsculas de membranas celulares. La técnica consiste, esencialmente, en presionar la punta de una micropipeta de vidrio contra la superficie de la membrana con ayuda de un microscopio y un micromanipulador, formándose un cierre hermético. Hacia 1982 ya se habían desarrollado técnicas para sellar el fragmento de membrana contra la punta de la pipeta, obteniéndose resistencias del orden de gigaohmios, lo cual permitía registrar corrientes tan pequeñas como 0.1 pA. Este elevadísimo grado de sensibilidad permitió detectar las corrientes iónicas debidas a canales iónicos aislados.

La técnica del pinzamiento zonal admite diversas variantes. Si después de sellar la punta de la pipeta contra la membrana se aplica una pequeña succión, el fragmento de membrana pinzado se rompe, con lo que se consigue el registro de la célula completa ("whole-cell recording", en inglés), que permite cuantificar la corriente que atraviesa toda la superficie de una célula individual. Separando la pipeta de la célula a partir de esta configuración, los bordes de la membrana unidos a la punta de la pipeta se sellan, permitiendo así el registro exterior-fuera ("outside-out patch recording", en inglés), en el que se pueden determinar las corrientes iónicas que atraviesan los canales presentes en el fragmento de membrana atrapado. Como el diámetro de la micropipeta empleada es extemadamente pequeño, la corriente detectada corresponde a apenas uno o dos canales iónicos. Por último, separando la pipeta de la célula antes de aplicar la pequeña succión, se puede obtener el registro interior-fuera ("inside-out patch recording", en inglés), ya que el parche de membrana queda evertido.

Microscopía de fuerza atómica.

Gerd Binnig introdujo esta técnica en 1986, el mismo año en que recibió el Premio Nobel de Física (junto con Heinrich Rohrer y Ernst Ruska) por el desarrollo de la microscopía de efecto túnel. En la actualidad, la microscopía de fuerza atómica es la única técnica que permite obtener imágenes de muestras con resolución por debajo del nanómetro y que puede operar en disolución. El microscopio de fuerza atómica usa una aguja muy fina al final de un soporte flexible para hacer un barrido sobre la superficie de la muestra. Las deflecciones del soporte medidas a una resolución de unos pocos ángstroms sirven para determinar el contorno de la muestra, generando imágenes que muestran la topografía de la superficie de las biomoléculas analizadas. Esta técnica resulta particularmente atractiva porque no sólo revela la superficie de un objeto en su estado nativo sino que además ofrece una relación señal:ruido excepcionalmente elevada. Con esta técnica ya se han conseguido sorprendentes imágenes que revelan características submoleculares de biomoléculas aisladas. Es más, se pueden detectar mínimos cambios estructurales en la superficie de una biomolécula con una resolución temporal de unos pocos milisegundos, suficiente para poder monitorizar los cambios conformacionales implicados en procesos biológicos concretos. Además, la aguja del microscopio de fuerza atómica puede considerarse una nanoherramienta que permite manipular moléculas aisladas.

Técnicas ópticas.

A diferencia de la microscopía de fuerza atómica, las técnicas ópticas no se restringen al análisis de superficies y, por tanto, resultan mucho más versátiles en relación al ambiente molecular, ofreciendo una aproximación particularmente atractiva para analizar moléculas en equilibrio termodinámico, ya que estas técnicas causan una mínima interferencia con el sistema biológico sometido a estudio.

Aunque ya se ha conseguido SMD aplicando la espectroscopía Raman, la inmensa mayoría de las aplicaciones de técnicas ópticas para SMD están basadas en métodos espectroscópicos para la detección de moléculas fluorescentes. Un principio espectroscópico que ha progresado recientemente hasta convertirse en una de las más prominentes herramientas para el estudio de moléculas individuales es la transferencia de energía de resonancia (FRET). La FRET es un proceso no radiativo por el cual la energía de un fluoróforo donador excitado es transferida a un fluoróforo aceptor en estado basal situado a una distancia en el rango del nanómetro. El empleo de la FRET permite realizar estudios de colocalización y/o interacción biomolécula-biomolécula, así como analizar cambios conformacionales dentro de una biomolécula dada.

Haces de luz láser pueden ser empleados como auténticas pinzas ópticas que permiten atrapar y manipular biomoléculas individuales con gran precisión. Manipulando la fuerza que se aplica a estas pinzas ópticas se obtiene una respuesta similar a los cambios en el estado de compresión de un muelle regidos por la ley de Hook. Se pueden registrar desplazamientos con una precisión por debajo del nanómetro, que corresponde con una precisión en la medida de la fuerza aplicada por debajo del piconewton. De esta forma, ya es posible analizar el funcionamiento de motores moleculares individuales.

Una técnica SMD particularmente elegante con un muy elevado grado de confianza estadística es la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS). A ella dedicaremos un futuro artículo en Encuentros en la Biología.

Miguel Ángel Medina Torres es Profesor Titular en el Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la UMA.